Sanger sequencing

Что такое секвенирование?

Молекула ДНК является носителем генетической информации практически во всех живых организмах. Она состоит из двух комплементарных, то есть соответствующих друг другу цепей нуклеотидов, формирующих уникальную последовательность.

Пару комплементарных нуклеотидов в составе цепи ДНК также называют парой оснований, сокращенно п.о.

Человеческий геном содержит около 3-х миллиардов пар оснований.

Секвенирование — метод, который используется в лабораторной практике для определения последовательности ДНК.

В диагностике его часто используют для поиска изменений в структуре генов или их регуляторных элементов, вызывающих заболевания (патогенные мутации, варианты).

Секвенирование по Сэнгеру

Секвенирование по Сэнгеру относится к классическим методам секвенирования. Метод был разработан в 1977 г. Фредериком Сэнгером и его коллегами. С его помощью в 1990-2003 г.г. в рамках проекта «Геном человека» был впервые полностью расшифрован человеческий геном.

Секвенирование по Сэнгеру и в настоящее время не теряет своей актуальности и является рутинным методом как в генетической диагностике, так и в научно-исследовательской практике. С его помощью за один рабочий цикл можно «прочитывать» последовательности длиной до 1000 пар нуклеотидов с высокой точностью — до 99%.

Сейчас метод секвенирования по Сэнгеру полностью автоматизирован. Автоматизация делает его надёжным и простым в исполнении, он является «золотым стандартом» современного секвенирования. С автоматизацией и увеличением производительности секвенаторов уменьшилась и стоимость данного метода.

Точность до 99%

за один рабочий цикл можно «прочитывать» последовательности длиной до 1000 пар нуклеотидов с высокой точностью — до 99%

Показания

Для подтверждения данных, полученных методом NGS при выявлении патогенных вариантов или вариантов с неизвестной клинической значимостью.
Для установления генетического статуса пациента в случае, когда у кого-либо из родственников уже была выявлена мутация и ее точное положение в геноме известно.

Из-за большого объема анализируемых последовательностей при использовании метода NGS некоторые участки могут быть прочтены неточно, поэтому в случае обнаружения находок методом NGS рекомендуется подтверждать их с помощью секвенирования по Сэнгеру.

Особенности метода

В основе метода секвенирования по Сэнгеру лежит использование дидезоксинуклеотидов, также известных как «терминирующие» нуклеотиды.

1. Подготовка материала

В пробирке проводят реакцию синтеза ДНК по уже существующей матрице (одноцепочечной генетической последовательности конкретного индивида), последовательность которой нужно установить.

2. Полимеразная цепная реакция

Молекулу ДНК синтезирует фермент ДНК-полимераза, которая, в соответствии с матрицей, по одному встраивает нуклеотиды в растущую цепь.

Среди всех нуклеотидов имеется 1% «терминирующих», каждый из которых также несет особую флуоресцентную метку.

После встраивания таких нуклеотидов дальнейший синтез цепи становится невозможен. Ввиду того, что встраивание «терминирующего» меченного нуклеотида в растущую цепь ДНК — случайное событие, оно может с равной вероятностью произойти как в самом начале, так и после синтеза большей части комплементарной молекулы.

В результате образуется смесь уникальных фрагментов ДНК разной длины, которые начинаются одинаково, но заканчиваются в разных положениях вдоль цепи ДНК-матрицы. Причём заканчиваются они одной из четырёх нуклеотидных меток.

3. Разделение фрагментов и детекция сигнала

Затем происходит разделение этих фрагментов по величине с помощью капиллярного электрофореза.

Синтезированные фрагменты ДНК разделяются под действием электрического поля: чем меньше фрагмент, тем он быстрее движется в геле.

Таким образом фрагменты «выстраиваются» в капилляре по длине.

После происходит детекция флуоресцентного нуклеотида на конце каждого фрагмента и определяется полная нуклеотидная последовательность исследуемого образца ДНК.

NGS vs Сэнгер

С момента изобретения секвенирования по Сэнгеру продолжались поиск и разработка альтернативных способов расшифровки ДНК. В последнее время большой популярностью пользуются методы секвенирования нового поколения (NGS). Однако, у каждой технологии есть свои особенности и выбор метода обычно производится исходя из поставленной задачи.

Метод секвенирования по Сэнгеру имеет ограничения

С его помощью можно прочитать только последовательности ДНК до 1000 пар оснований, полученные от одного человека, за один раз.
Кроме того, невозможно детектировать изменения в некоторой популяции клеток, когда в большей части образца представлена нормальная копия гена. Например, в опухолевых клетках происходят изменения, вызывающие их бесконтрольный рост. Такие изменения не будут присутствовать ни в каких других клетках организма.
Секвенирование по Сэнгеру позволяет детектировать изменения только если они проявляются не менее чем в 15-20% исследуемой ДНК.

15-20%

исследуемого материала должно содержать изменения, чтобы их можно было детектировать методом Сэнгера

Методы секвенирования нового поколения

Позволяют получить данные о более длинных последовательностях ДНК (вплоть до полногеномного секвенирования) и детектировать варианты (мутации), содержащиеся примерно в 5% исследуемой ДНК. Однако это происходит за счет одновременного прочтения большого числа коротких (в среднем, для методов, наиболее часто используемых в клинических лабораториях, 100-300 п.о.) последовательностей ДНК, которые затем соединяются и анализируются.

Процесс обработки таких данных достаточно трудоемкий и требует высокого уровня квалификации специалиста.
При этом точность интерпретации отдельных участков зависит от того, сколько раз этот участок был «прочитан».
В тех случаях, когда есть подозрения, что выявленный вариант является причиной заболевания, необходима 100% уверенность в правильном прочтении. Тогда имеет место подтверждение наличия патогенного или условно-патогенного варианта методом Сэнгера.
Также методы NGS являются дорогостоящими, из-за чего анализ с их помощью коротких последовательностей экономически невыгоден.

Поэтому, когда известны точные координаты предполагаемого изменения в геноме (например, если у кого-то из близких родственников был обнаружен патогенный или условно-патогенный вариант), проводить для него полноэкзомное секвенирование не обязательно. Можно просто секвенировать интересующий участок ДНК методом Сэнгера.
5% исследуемого материала должно содержать изменения, чтобы их можно было детектировать методом нового поколения (NGS)

исследуемого материала должно содержать изменения, чтобы их можно было детектировать методом нового поколения (NGS)