Позвонить 8 (800) 201 67 33
Расширенное исследование цоДНК+РНК (жидкостная биопсия)
ЧТО ТАКОЕ ЖИДКОСТНАЯ БИОПСИЯ?
Жидкостная биопсия — это способ получения биоматериала и анализ опухолевых компонентов, прежде всего опухолевых нуклеиновых кислот в образце крови.
С помощью жидкостной биопсии можно исследовать разные компоненты биологического материала, которые морфологически можно разделить на две категории:
Молекулы без клеток или без субклеточной структуры в жидкости организма: белки, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы, другие небольшие метаболиты и ионы металлов
Компоненты с клеточной или субклеточной структурой: одиночные/кластерные циркулирующие опухолевые клетки, циркулирующие фибробласты, ассоциированные с опухолью, иммунные клетки, тромбоциты, образованные опухолью, внеклеточные везикулы и циркулирующие митохондрии
Однако на сегодняшний день только циркулирующая опухолевая ДНК и циркулирующие опухолевые клетки являются компонентами, клиническое применение которых одобрено Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA). [6]
Термины и аббревиатуры
вкДНК (внеклеточная ДНК) — это короткие (преобладающая длина 90 — 200 пар нуклеотидов) фрагменты ДНК в плазме крови, происходящие в основном из апоптотических и некротических клеток.
цоДНК (циркулирующая опухолевая ДНК) — это вкДНК, происходящая из клеток опухоли.
цоРНК (циркулирующая опухолевая РНК) — циркулирующая внеклеточная РНК из клеток опухоли. Является довольно нестабильной молекулой (период полураспада в плазме 15 с), однако при взаимодействии с белками, протеолипидными комплексами или внеклеточными везикулами стабильность увеличивается.
ЦОК (циркулирующие опухолевые клетки) — опухолевые клетки, которые отделились либо от первичной опухоли, либо от метастатического образования. Период полужизни такой клетки — от 1 до 2,4 часов [7]. Присутствие ЦОК в кровотоке имеет основополагающее значение для развития метастазирования при различных типах солидных опухолей. Однако популяция ЦОК очень гетерогенна и такие клетки циркулируют в небольшом количестве, из-за чего ЦОК достаточно сложно точно обнаружить.
Экзосомы — мембранные пузырьки, принадлежащие к большому классу внеклеточных везикул диаметром 40 до 160 нм. Экзосомы могут опосредовать клеточную коммуникацию в нормальных и патологических условиях, транспортируя определенные молекулы (нуклеиновые кислоты или белки), отражающие состав клеток, из которых они произошли. Экзосомы, как показывают исследования, играют важную роль в канцерогенезе, развитии опухолей, метастазировании и лекарственной резистентности [8].
Опухолевые компоненты в жидких биоптатах и их применение. Преимущества и недостатки, возможности для использования в клинической практике.
Факторы, влияющие на высвобождение циркулирующих опухолевых нуклеиновых кислот
Циркулирующие опухолевые нуклеиновые кислоты (цоНК) могут пассивно высвобождаться в кровоток, главным образом, посредством апоптоза и некроза, а также путем активной секреции через внеклеточные везикулы из жизнеспособных клеток.
Лучевая терапия
Лучевая терапия вызывает высвобождение циркулирующих опухолевых НК в зависимости от типа клеток. Лучевая терапия вызывает некроз и считается потенциальной причиной некротического выброса вкДНК. Однако механизм гибели клеток зависит от типа клеток и молекулярных аберраций, присутствующих в клетках. Лучевая (или химио) терапия может вызывать клеточное старение в одном типе клеток и митотическую катастрофу в другом, далее может последовать поздний вторичный апоптоз и некроз.
Клеточное старение
Клеточное старение представляет собой постоянную остановку клеточного цикла, вызванную различными внутренними и внешними стимулами, такими как стресс ДНК и повреждение во время цитотоксической терапии. Старение было замечено как потенциальный противодействующий фактор высвобождения вкДНК [9].
Гипоксия
Гипоксия — состояние пониженного уровня кислорода в тканях, является каноническим признаком рака, сопровождающим неконтролируемый рост опухоли. Согласно исследованиям, уровень цоДНК в крови мышей с пересаженными клетками эпителиального рака легкого значительно увеличился после воздействия прерывистой гипоксии [10]. Также было показано, что длительная гипоксия отрицательно модулирует высвобождение цоДНК [11].
Гибель клеток
Гибель клеток может косвенно индуцировать активное высвобождение циркулирующих опухолевых нуклеиновых кислот через внеклеточные везикулы жизнеспособных клеток [12].
Характеристики циркулирующих опухолевых нуклеиновых кислот
Период полужизни
Предполагаемый период полураспада цоДНК в кровообращении колеблется от минут до 1-2 часов. Этот факт указывает на то, что анализ цДНК отражает заболевание в реальном времени. Продолжительность периода полужизни цоДНК связана со многими факторами, такими как: инкапсуляция в мембраносвязанных везикулах, ассоциация с белковыми комплексами, тип опухоли и лечения [13].
Длина
Преобладающий размер вкДНК около 166 пн [4, 5], соответствующий размеру фрагментов мононуклеосомной ДНК, подтверждает предположение, что апоптоз является основным источником вкДНК. цоДНК обычно короче, чем бесклеточная ДНК: < 145 п.о.[14]. ВкДНК некротического происхождения имеет большую длину.
Концентрация
вкДНК
В целом повышенное содержание
внеклеточной ДНК в крови можно рассматривать как показатель необычно высокой гибели
клеток, связанной с различными патологическими состояниями. Например, когда опухоль
увеличивается в объеме, также увеличивается клеточный оборот и, следовательно,
количество апоптотических и некротических клеток. У здорового человека вкДНК
обычно имеет низкую концентрацию в плазме со средним значением около
5 нг/мл, но различается у разных людей.
цоДНК
При злокачественном новообразовании
концентрация цоДНК может сильно различаться в зависимости от размера опухоли,
стадии, локализации и других факторов, при этом доля цоДНК составляет
от 0,01 до 90%.
Локализация опухоли и цоДНК
Проведено исследование [15], согласно результатам которого цоДНК была выявлена среди более 75% пациентов со следующими видами злокачественных опухолей:
- распространенный рак поджелудочной железы,
- яичников,
- колоректальный рак,
- рак мочевого пузыря,
- желудочно-пищеводный рак,
- рак молочной железы, меланома,
- гепатоцеллюлярный рак
- рак головы и шеи.
Однако при первичном раке головного мозга, почки, простаты и щитовидной железы частота обнаружения цоДНК была ниже 50%.
Недавние исследования показывают, что с концентрацией цоДНК в крови больше коррелируют характерные признаки опухоли, такие как скорость некроза, нежели локализация. Например, плоскоклеточная карцинома легкого с более высокой скоростью некроза имеет более высокие показатели обнаружения цоДНК по сравнению с аденокарциномами. А также более высокие уровни цоДНК наблюдались при тройном негативном раке молочной железы по сравнению с другими подтипами [16], что можно обосновать более высокой скоростью некроза и пролиферации клеток данного подтипа.
Высокая концентрация вкДНК может быть связана с плохим прогнозом, однако многочисленные исследования демонстрируют, что только количество внеклеточной ДНК без изучения наличия опухолевых мутаций не является полезным диагностическим инструментом [1, 2, 3].
Учёт молекулярной гетерогенности и эволюции опухоли
Молекулярная и клеточная гетерогенность является отличительной особенностью рака и одной из самых больших проблем диагностики и терапии опухолей. В отличие от традиционной биопсии отдельных тканей, в кровь высвобождается ДНК всех популяций опухоли, в том числе метастазов в связи с этим увеличиваются возможности подбора комбинированной терапии. В связи с этим проведение жидкостной биопсии на ограниченное число генов (и тем более отдельных мутаций в этих генах) менее эффективно.
Клиническое применение цоДНК
Жидкостная биопсия на основе цоДНК может обеспечить минимально инвазивную оценку гетерогенности опухоли и ответа на лечение в режиме реального времени, поскольку она использует цоДНК, высвобождаемую из различных опухолевых субклонов, которые нельзя исследовать с помощью локально ограниченной биопсии ткани.
Было показано, что мутации, обнаруженные в цоДНК, согласуются (до 90%) с соответствующими солидными опухолями [17]. Расхождения между цоДНК и анализами солидной опухолевой ткани наблюдаются в основном у пациентов с низким уровнем цоДНК [17].
С помощью цоДНК можно отслеживать динамику эволюции опухоли:
Синяя линия показывает уровень цоДНК, несущей мутацию, обнаруженную как в первичной опухоли, так и в крови. Желтая линия показывает уровень цоДНК, представляющий мутацию, возникшую при резистентности к лечению.
MRD — минимальная остаточная болезнь,
WGS — полногеномное секвенирование,
WES — полноэкзомное секвенирование,
NGS — секвенирование нового поколения,
LOD — предел обнаружения,
ddPCR — цифровая капельная ПЦР,
qPCR — количественная ПЦР.
Анализ цоДНК может быть реализован в различных клинических условиях: при скрининге и раннем выявлении МОБ, характеристике опухоли, эффективности лечения и мониторинге рецидивов.
Активно высвобождаемая цоДНК может иметь клиническое значение у больных раком с риском наличия спящих диссеминированных опухолевых клеток (ДОК).
Анализ цоНК требует понимания преаналитических и аналитических параметров, которые могут повлиять на точность и воспроизводимость результатов в данном клиническом контексте. Основными преаналитическими переменными являются специфические для пациента факторы, влияющие на высвобождение цоНК, объем образца, пробирку для сбора, условия хранения и обработки. Специфические для пациента факторы включают физиологические состояния (например, физические нагрузки), воспаление, а также острые и хронические заболевания. Следовательно, время сбора плазмы следует тщательно планировать.
Количество ДНК плазмы, доступное для тестирования, прямо пропорционально объему плазмы, извлеченной из нее, и поэтому объемный отбор проб должен быть тщательно спланирован заранее, чтобы гарантировать наличие достаточного количества анализируемого вещества для решения клинического вопроса.
О нашем тесте
ВкНК/цоНК можно исследовать методом NGS. При проведении данного исследования очень важна высокая чувствительность метода.
В нашем тесте используются уникальные молекулярные идентификаторы (UMI) — короткие последовательности ДНК, прикрепляющиеся к геноспецифическим праймерам перед амплификацией. Впоследствии достоверными считаются только варианты, проявляющиеся более чем в 80% последовательностей с определенной меткой UMI. Такая система позволяет избегать случайные ошибки, возникающие в процессе создания библиотеки ДНК.
до 0,1%
частоты аллеля — предел обнаружени
Панель включает 52 гена
AKT1
ALK
AR
ARAF
BRAF
CHEK2
CTNNB1
DDR2
EGFR
ERBB2
ERBB3
ESR1
FGFR1
FGFR2
FGFR3
FGFR4
FLT3
GNA11
GNAQ
GNAS
HRAS
IDH1
IDH2
KIT
KRAS
MAP2K1
MAP2K2
MET
MTOR
NRAS
NTRK1
NTRK3
PDGFRA
PIK3CA
RAF1
RET
ROS1
SF3B1
SMAD4
SMO
ALK
BRAF
ERG
ETV1
FGFR1
FGFR2
FGFR3
MET
NTRK1
NTRK3
RET
ROS1
CCND1
CCND2
CCND3
CDK4
CDK6
EGFR
ERBB2
FGFR1
FGFR2
FGFR3
MET
MYC
APC
FBXW7
PTEN
TP53
Преимущества
- Минимальная инвазия
- Исследование генетического профиля опухолей труднодоступной локализации
- Отражение гетерогенности опухоли и системности заболевания
- цоДНК может служить лучшим показателем опухолевой нагрузки и гетерогенности с более высокой чувствительностью и специфичностью, чем анализ солидных опухолей
- В настоящее время анализ цоДНК обладает наивысшей клинической валидностью среди биомаркеров на основе жидкостной биопсии и наиболее близок к внедрению в клиническую практику
Ограничения
- Гетерогенность опухоли, ее эволюция и клональный гемопоэз могут частично вызывать
неоднозначность данных измерения c цоДНК.
В настоящее время не существует единого анализа цоДНК, который подходил бы для всех целей (например, раннее обнаружение, анализ МОБ, идентификация генетических изменений и оценка генетической гетерогенности опухоли, выявление молекулярных механизмов резистентности) - Риск ложноотрицательного результата при низкой фракции цоНК среди вкНК.
- Риск ложноотрицательного результата при несоблюдении преаналитических данных.
Показания к исследованию
- Поиск маркеров для назначения таргетной терапии
- Определение
- предикторов метастаза
- молекулярного профиля труднодоступных новообразований
- прогноза рецидива
- Мониторинг терапии
Рекомендации экспертных сообществ
ESMO (Европейское Общество Медицинской Онкологии) [18].
Общие рекомендации
Валидированные и чувствительные методы тестирования цоДНК можно использовать для выявления поздних форм рака и подбора таргетной терапии.
Первичное тестирование с помощью анализа цоДНК следует рассматривать, когда необходимо быстро получить результаты исследования, а ткань недоступна.
Тестирование цоДНК ограничено ложноотрицательными результатами, более низкой чувствительностью к химерным транскриптам и изменениям числа копий генов.
Использование цоДНК для выявления минимальной остаточной болезни не рекомендуется из-за отсутствия доказательств ее клинической полезности.
Рак легких
Текущие клинические рекомендации ESMO по метастатическому НМРЛ рекомендуют тестирование всех пациентов с неплоскоклеточным НМРЛ и плоскоклеточным подтипом НМРЛ с особыми клиническими характеристиками (например, никогда не курящие). Анализы цоДНК можно проводить у пациентов, ранее не получавших лечения, и это особенно рекомендуется, когда ожидается значительная задержка в получении опухолевой ткани, когда инвазивные процедуры могут быть рискованными или противопоказанными, или кость является единственным участком, который может быть подвергнут биопсии.
Небольшие по объему преимущественно внутригрудные опухоли или преимущественно внутричерепные опухоли связаны с высоким уровнем ложноотрицательных результатов.
Последовательность тканевой РНК может идентифицировать большее количество вариантов сайта сплайсинга, таких как пропуск экзона 14 MET и химерные варианты (например, ALK , RET , ROS1 или NTRK 1/2/3).
Для пациентов с заболеванием, ранее получавшим лечение, резистентная мутация EGFR T790M позволяет проводить лечение осимертинибом.
Рак молочной железы
Тестирование может быть показано для выявления мутаций PIK3CA и ESR1 при заболеваниях, положительных по рецептору эстрогена (ER), отрицательных по рецептору 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), а также для обнаружения MSI.
Тестирование может быть показано для обнаружения амплификации HER2 только в ситуациях, когда тестирование HER2 не может быть проведено при биопсии распространенного заболевания, поскольку обнаружение амплификации HER2 неоптимально в цоДНК (зависит от анализа).
Мутации ESR1 приобретаются субклонально при раке, и надежная идентификация наличия мутации ESR1 более вероятна при проведении жидкостной биопсии, при этом биопсия тканей часто дает ложноотрицательные результаты.
Следует соблюдать осторожность при интерпретации патогенных вариантов в генах предрасположенности к раку с высокой пенетрантностью (таких как BRCA1, BRCA2, PALB2). Для подтверждения герминальной или соматической природы необходимо провести валидированное тестирование.
Колоректальный рак
Жидкостная биопсия, включающая по крайней мере тестирование на KRAS/NRAS/BRAF V600E /MSI для метастатического колоректального рака без химиотерапии, рекомендуется, когда тестирование тканей невозможно или когда требуется быстрое терапевтическое решение, а также тестирование KRAS/NRAS и внеклеточного домена EGFR (EGFR -ECD, мутации в S492, G465, S464 и V441) рекомендуются, когда рассматривается повторная стимуляция моноклональными антителами против EGFR.
Рак верхних отделов ЖКТ
Ввиду их распространенности и доступности одобренных методов лечения, тестирование цоДНК на ERBB2 при раке желудка, IDH1 и FGFR2 при холангиокарциноме рекомендуется, когда тестирование тканей невозможно или когда требуется срочное принятие решения о быстром терапевтическом вмешательстве.
Общие рекомендации по локализации опухоли
Чувствительность анализа цоДНК снижается при местатическом поражении центральной нервной системы и при первичных опухолях головного мозга, и жидкостная биопсия обычно не подходит для исследования таких пациентов, хотя можно попытаться, если это единственная возможность провести генетическое тестирование. Данные свидетельствуют о том, что генетическое тестирование можно провести с помощью анализа спинномозговой жидкости.
NCCN
- Поддерживает диагностические исследования для поздних стадий НМРЛ, включая исследование молекулярных биомаркеров.
- Осторожно напоминает клиницистам, что тестирование на биомаркеры нельзя использовать в качестве основы для постановки гистопатологического диагноза (NCCN, 2021).
- Признает тестирование вкДНК у пациентов при отсутствии возможности тестирования тканей и в случаях, когда недоступно получение материала, достаточного для молекулярного анализа.
- Также признает необходимость тестирования при прогрессировании заболевания, когда тканевая биопсия не выявляет молекулярных биомаркеров.
Как заказать исследование Жидкостная биопсия?
1
2
Заполнить информированное согласие и оставить заявку
Скачать и заполнить информированное согласие
3
Оплатить исследование на сайте
4
Сдайте венозную кровь
Необходимо сдать кровь в специальную пробирку* для стабилизации внеклеточной ДНК в любой лаборатории вашего города. Обязательно подпишите пробирку!
* Пробирку Вам доставит курьер по адресу, указанному в заявке, после ее оформления и оплаты услуги.
5
6
Получить результаты исследования на эл. почту
Результаты исследования могут быть интерпретированы только врачом-генетиком или врачом-онкологом.
Лаборатория First Genetics
Специалисты
Многолетний опыт работы в области генетики, лабораторной диагностики и биоинформатики
Конфиденциальность
Все данные строго конфиденциальны и не могут быть переданы третьим лицам
Срок
Результаты в короткие сроки
Надежность
Особый контроль на каждом этапе проведения исследования
Бесплатная доставка
Доставка биоматериала по всей России
Благотворительные фонды
Для получения информации напишите на info@f-genetics.com
